1. 개요
Knock-out Mouse넉아웃 마우스는 동물 임상 실험과 각종 줄기세포 실험에서 사용되는 동물이다. DNA의 유전자 조작을 통해서 만들어진다.
2007년 노벨상의 생리의학상 수상 내용이다.
2. 제작 과정
유전자 타겟팅을 이용하여 만들게 된다.외부 플라스미드에 타겟 DNA와 유사한 (거의 일치해야한다) 염기서열을 만들고 그 사이에 네오마이신 저항성 유전자를 삽입한다. 또 인위적으로 만든 유전자와 매우 가까운 거리에 티미딘 인산화 유전자를 같이 집어 넣는다. 이후 이 플라스미드를 쥐의 ES 세포에 주입한다.
플라스미드와 쥐의 염색체에서 상동 재조합이 일어나도록 한다.
이제 상동 재조합된 세포를 선별해야한다.
그림으로 보면 다음과 같다.
상동 재조합된 경우 인위적으로 타겟 유전자를 복제하여 만든 서열끼리만 상동 재조합이 일어나 티미딘 인산화 유전자는 쥐의 염색체에 삽입되지 않는다. 또 인위적으로 만든 DNA 안에 네오마이신 저항성 유전자가 있기 때문에 네오마이신에 대한 저항성을 가진다.
비상동 재조합된 경우 인위 제작된 DNA 서열이 아무 곳에나 끼어들어간다. 이 때 티미딘 인산화 유전자를 최대한 가까운 거리에 집어 넣었기 때문에 비상동 재조합된 경우 네오마이신 저항성 유전자와 티미딘 인산화 유전자가 같이 삽입된다. 이렇게 되면 티미딘 인산화 유전자에서 티미딘 인산화 효소가 ganciclovir를 인산화 시켜 dGTP와 경쟁을 하게 되고 이 물질이 중합에 사용되면 DNA는 더 이상 중합하지 못해 죽게된다.
따라서 한 번의 양성 선택 (네오마이신 저항성)과 한 번의 음성 선택 (ganciclovir 저항성)을 통해 상동 재조합된 ES 세포만을 얻을 수 있다.
단 재조합 시킬 ES 세포는 갈색털 쥐의 배반포에서 얻어야한다.
또 이 때 재조합된 ES 세포는 상동염색체에 존재하는 유전자의 하나만 넛아웃된 이형접합자이다.
상동 재조합은 매우 드문 확률로 일어나기 때문에 두 개의 상동염색체에서 모두 재조합이 일어나는 경우는 극히 드물다.
재조합된 ES 세포를 키워서 검정털 쥐의 4-5일된 배반포의 내세포괴에 넣고 골고루 섞어준다.(배반포 상태에서는 면역이 성립되지 않아 유전자형이 다르더라도 잘 산다)
이 섞인 수정란을 대리모에 착상 시켜 출산하게 되면 검정색 쥐 혹은 키메라 (색이 섞여 있는) 쥐가 나온다. 여기서 처음에 형질 전환하기 위해서 갈색털의 쥐 세포를 사용했으므로 우리는 키메라 쥐만을 가지고 다음 단계로 넘어간다.
먼저 알아둬야 할 사실이 쥐는 갈색털이 검정털에 대해서 우성이다.
키메라 쥐에서는 일부 생식줄기세포에서도 재조합된 세포들이 있기 때문에 그 줄기세포들에서 생성된 생식 세포는 갈색털 유전자와 재조합된 타겟 유전자를 가질 것이다. 혹은 갈색털 유전자와 정상 타겟 유전자를 가질 수 있다.
키메라 쥐와 검정털 쥐를 교배하여 갈색 쥐를 선별한다. 위에서 말했듯이 갈색털 유전자를 가지는 생식세포는 타겟 유전자가 넉아웃 되었을 수도 있고 아닐 수도 있다. 이제 유전자 분석을 통하여 넉아웃된 개체들을 선별한다. 이 개체들 또한 타겟 유전자에 대해 이형접합자이다.
마지막으로 이형접합자의 갈색털 쥐들을 교배하고 유전자 분석을 통해 타겟 유전자가 모두 넉아웃된 동형접합자의 쥐를 찾으면 넉아웃 마우스이다. 이 때 나오는 쥐의 털이 검정색일 수도 있다. 검정색이 열성이기 때문.
한겨레의 기사가 항목의 내용을 가볍게 다루고 있으므로 아예 이해가 되지 않는다면 읽어보길 바란다.